据预测，干细胞可以改善疾病结果和患者生活。通过控制细胞形状来引导干细胞命运可能会大大加速实现这一目标的进展。由于间充质基质细胞（MSC）在体内不断暴露于动态变化的生物力学环境，我们假设外源性的力量可以应用于工程的各种显着不同的MSC形状。我们将特定的周期性拉伸方案应用于人MSC，并定量测量所得的细胞形状、排列和平滑肌（SMC）分化标志物的表达，因为这些与细长形态相关。作为原理证明，通过改变应变、长度和重复拉伸产生一系列不同的形状、排列和相关SMC标志物水平。然而，生物力学工程细胞形状的主要决定因素是重复选择的拉伸方案，表明工程形状和相关的分化是依赖于持续的生物力学刺激的复杂的非线性过程。因此，力是干细胞形状的关键调节因子，并且通过生物力学力对特定MSC形状的靶向工程化代表了一种新的机械生物学概念，其可以利用天然存在的体内力来改善临床再生疗法中的干细胞命运。
Introduction 介绍间充质基质细胞（MSC）因其在体外分化成广泛的体细胞的能力而众所周知，所述体细胞包括成骨、成软骨、成脂、成肌、内皮和神经源性谱系1、2、3、4、5、6、7。间充质干细胞被认为是成人，自我更新，多能干细胞与治疗用途的巨大潜力8，9。据预测，它们将大大改变疾病的结果和患者的生活10，更好地理解和控制MSC的特性可以大大加速这一目标的实现。
细胞形状是增殖的基本信号11，有效地调节细胞生长和生理学，并且指示特定功能12。膜突起影响细胞形状并且与粘附、迁移和刚性感测高度相关13。此外，特定的MSC形状伴随着分化成不同的细胞谱系，因为圆形MSC形状与成脂分化相关，而细长形状与肌生成相关14，15，16，17。利用MSC形状与功能的这种关联，先前的研究使用粘合剂微图案化表面18、19和多孔聚碳酸酯膜17产生了用于确定谱系定型的特定细胞形状。其他研究已经使用循环张力来诱导肌原性分化，同时基于伸长的MSC表达平滑肌细胞（SMC）的标志物17的观察结果产生动态伸长的细胞形状16、20。因此，MSC的形状将可能在理解和工程化组织结构以用于未来的应用中发挥重要作用。
以前，我们证明了许多MSC的几何形状可以通过半自动化高通量方法定量计算数学形状描述符来测量21。这些形状描述符描述了细胞形态的不同方面（图1）。使用这种方法和影响MSC形状的竞争线索系统（通过循环拉伸对形状产生动态影响，通过刚度定义的生物材料对形状产生静态影响），我们发现拉伸细胞不一定产生细长的MSC;相反，它产生的MSC最终比未拉伸的对照组更圆21。在本研究中，我们提出了一个基本问题，即循环拉伸方案是否可以用于工程化各种确定的细胞形态，是否可以用这种方法产生细长的MSC，以及对SMC标志物表达的影响。这些问题是重要的，因为干细胞连续地暴露于动态变化的机械环境22，其充当它们命运的关键调节器22，23，并且因为通过生物力学力产生各种形状理论上可以在体内用于控制MSC功能。我们的一般假设是，包括最大应变、拉伸时间和重复优化拉伸方案（在连续两天用相同参数拉伸相同标本）的不同参数将产生显著不同的MSC形态，并且改变这些参数可用于特异性地产生伸长的MSC形状。因此，我们将特定的循环拉伸方案应用于接种在压缩胶原蛋白片上的人骨髓源性MSC（与用于肌源性分化的纳米级刚度匹配24），并评估这种刺激对细胞表型的影响。为了评估细胞形状对表型的影响，我们研究了SMC标志物的表达作为拉伸和相应形态的函数。伸长的MSC形态通常与SMC标志物的表达增加相关16，17，并且由于生物力学力增加MSC向SMC表型的分化14，15，16，我们预期这些反应是相关的。最后，因为已知周期性拉伸影响细胞相对于拉伸方向的排列14、15、16、20、25、26、27，我们询问周期性拉伸如何影响MSC排列以及这些变化是否可以通过细胞形态来解释。总的来说，我们的目标是通过定义的循环拉伸方案引入MSC形状的靶向工程的新概念;这将促进我们对细胞分化的理解，并有望在机械生物学，组织工程和临床再生医学中广泛的体外和体内应用。
使用Hyothetical MSC的形状因子的比较。图1概述了每个形状因子定义的单元格的不同特征。细胞长度测量每个细胞的“长轴”，并且在肌原性研究中经常使用，因为经历分化的细胞变得更长。细胞圆度是归一化为1的“面积”与“长轴”的比率。这种定量测量可用于描述细胞相对于其短轴和长轴55的肥大速率。具有不同圆度值的单元可以合理地具有相似的长度，反之亦然。圆度描述了第三个生物学相关特征，因为它在数学上测量了“面积”与“周长”的比率，标准化为1。当细胞扩散或开始迁移通过其周围环境时，它们伸出13。这可能会或可能不会通过改变细胞长度或圆度来捕获，但根据我们的定义，可以大大降低圆度。
Results 结果Shape Descriptor: Cell Length形状描述符：单元长度未拉伸的对照MSC随时间增加其细胞长度，但变化很小。在施加一种循环拉伸方案后，拉伸的细胞的细胞长度短于未拉伸的对照MSC的细胞长度，无论拉伸参数如何（p <0.001）。在第一拉伸方案期间增加的应变降低了MSC长度（图2A：1 × 5% vs. 10%; p < 0.05），并且增加的拉伸时间也降低了MSC长度（图2C：1 × 10% 3 h vs. 16 h; p < 0.05）。在第二天重复第二次周期性拉伸后，这些趋势完全逆转。对于包括对照的所有拉伸参数，第二天的第二拉伸方案产生比一个方案更长的细胞长度（图2B：1×对比2×对照，1×对比2×拉伸5%，1×对比2×拉伸10%，16 h; p < 0.05）。这种效应在较高的菌株（图2B; p < 0.05）和较长的拉伸时间（图2C：比较1×与 2 × 10%持续3 h至1× vs. 2 × 10%持续16 h; p < 0.05）。将细胞拉伸更长的持续时间与在不同应变下拉伸具有类似的效果。在一个方案后，增加应变的持续时间减少了细胞长度（图2C：1 × 10% 3 h vs. 16 h; p < 0.05），但在第二个方案后，更长的持续时间产生更长的细胞（图2C：2 × 10% 3 h vs. 16 h; p < 0.05）。最短的MSC是在单一方案中以高应变拉伸的群体中，并且在10%拉伸16 h的两种方案后观察到最高的MSC长度。这是应用时间最长的最高菌株。
拉伸参数对泡孔长度和圆度的影响。以较高的菌株拉伸细胞产生的细胞在一种方案后较短（p <0.05），但在两种方案后较长（p < 0.05）。无论细胞是否被拉伸，当针对另外的方案培养时，它们更长（B），（p < 0.05）。在一个拉伸方案后，拉伸较长时间段的细胞较短（p < 0.05），然而在第二拉伸方案后，拉伸持续时间增加导致细胞较长（C）（p < 0.05）。对于一种方案拉伸细胞在低应变下产生圆形细胞（p < 0.05），但在高应变下产生较少圆形细胞（D）（p < 0.05）。无论菌株（D）如何，对于两种方案拉伸的细胞都不太圆（p < 0.05）。如果细胞保持未拉伸，它们自然变圆，但如果它们被拉伸，则额外的方案降低圆度，而不管最大应变（E）如何（p < 0.05）。仅在一种方案后，拉伸细胞较长持续时间对细胞圆度没有影响，但在第二种方案后，较长持续时间的拉伸产生较少的圆细胞（F），（p < 0.05）。
Shape Descriptor: Cell Roundness形状描述符：细胞圆度接下来，我们分析了拉伸对细胞圆度的影响。使用单次拉伸方案，MSC圆度增加（图2D：1×对照vs 5%，持续16小时; p < 0.05）或与对照群体统计学上相同（图2D：1×对照vs 10%，持续16小时）。在第一拉伸方案后，增加的应变降低了MSC圆度（图2D：1 × 5%对10%，持续16小时; p < 0.05），但增加的拉伸时间对MSC圆度没有影响（图2F：1 × 10%，持续3小时对16小时）。通常，对照细胞比第二天重复方案拉伸的细胞更圆（图2D; p < 0.05），但圆度的这种降低不是应变依赖性的（图2D：2 × 5% vs. 10%，持续16 h）。虽然未拉伸的MSC的圆度随时间增加（图1 E：1×对比2×对照; p < 0.05），但拉伸的MSC圆度值低于一次拉伸方案后的圆度值（图2 E：1×对比2 × 5%，持续16小时，1×对比2 × 5%，持续16小时）。2 × 10%，16 h; p < 0.05）。与细胞长度不同，当使用不同菌株和不同持续时间时，在圆度变化中观察到不同的响应。在一个方案后，延长拉伸持续时间对细胞圆度没有影响（图2F; 1×对照vs. 10%持续3 h vs. 10%持续16 h），但在第二个重复方案后，延长持续时间降低了圆度（图2F：2 × 10%持续3 h vs. 16 h; p < 0.05）。总的来说，在5%和10%拉伸16 h的两种方案后观察到最低的MSC圆度，这是最长的拉伸时间。具有最高圆度的细胞是在两种拉伸方案所需的整个时间内静态培养的未拉伸对照。
Shape Descriptor: Cell Circularity形状描述符：细胞圆形接下来我们分析了MSC循环性。在单次拉伸方案后，MSC的圆形度高于对照（图3A：1×对照对5%，持续16小时; p < 0.05），并且这种差异随着应变而增加（图3A：1 × 5%对10%，持续16小时; p < 0.05）。在第二天的第二次重复拉伸方案之后，拉伸的细胞比对照的圆形度小，但是应变的量对细胞圆形度没有影响（图3A：2×对照对5%持续16小时和2×对照对10%持续16小时; p < 0.05）。未拉伸的对照MSC随时间增加其圆形度（图3B：1×对照对2×对照; p < 0.05），但拉伸细胞逆转了这种反应，与一种拉伸方案相比，两种方案拉伸的细胞的细胞圆形度普遍降低（图3B：1×对2×拉伸，5%持续16小时，1×对2×拉伸，10%持续16小时; p < 0.05）。在一个方案后，增加每个方案的时间长度也增加了所得的圆形度，甚至超过相应的对照（图3C：1×对照对10%持续3小时和1 × 10% 3小时对16小时，p < 0.05），然后在第二个方案后具有比对照更低的整体圆形度（图3C：2×对照对2 × 10% 3小时，2×对照对2 × 10% 16小时，p < 0.05）。总体而言，在两种拉伸方案的拉伸细胞中观察到最低的圆度，而拉伸方案的长度和应变的影响不太显著。在未拉伸的细胞或对于单一方案用高应变拉伸的细胞中观察到最高圆度。
拉伸参数对细胞圆度和取向的影响。用第一种方案拉伸的细胞圆形度增加，并且增加应变会加剧这种效应（A），（p < 0.05），但在第二种方案后，拉伸的细胞圆形度低于对照组（p < 0.05），但应变没有影响（A）。对照细胞在附加方案下具有显著更高的圆形度（p < 0.05），但拉伸的细胞在第二拉伸方案后具有更低的圆形度（B），（p < 0.05）。在一种方案后，拉伸较长持续时间的细胞具有较高的圆形度（p < 0.05），但在第二种方案后，它们的圆形度远低于对照（C）（p < 0.05）。延长牵张持续时间增加了一种或两种牵张方案后的圆形度（C）（p < 0.05）。以较高的菌株拉伸细胞产生更对齐的细胞（D），（p < 0.05）。对照细胞在额外的培养时间后更对齐（p < 0.05），并且重复拉伸方案产生对齐得多的细胞（E）（p < 0.05）。增加细胞被拉伸的时间长度会增加它们的对齐（F）（p < 0.05）。
MSC alignment relative to stretch相对于拉伸的MSC对齐为了评估周期性拉伸对细胞排列的影响，我们定量了细胞主轴相对于拉伸方向的角度，或者在对照MSC的情况下，相对于图像的水平轴的角度。拉伸通常增加平行于拉伸方向的对齐（图3D-F，p < 0.05）。以更高的应变拉伸MSC（图3D：2 × 5%对10%，持续16小时; p < 0.05）或持续更长的持续时间（图3F：2 × 10%，持续3小时对16小时; p < 0.05）导致MSC的更多对齐。即使是拉伸最高应变和最长持续时间的细胞，在单一方案后也与对照组具有统计学相似的角度（图3E：1×对照组与1 × 10%，持续16小时）。无论其他参数如何，其需要在第二天重复拉伸方案以诱导对齐，并且未拉伸的对照MSC保持各向同性，无论培养时间如何（图3E）。因此，拉伸一致地诱导MSC排列，并且排列的程度对应于拉伸的量，但有趣的是，这种效果仅在第4天和第5天的两种拉伸方案后可见。拉伸诱导的对准在图4A中示出。
拉伸和未拉伸的MSC的形状和细胞计数。用钙黄绿素染色粘附于I型胶原蛋白片的拉伸和未拉伸的MSC以说明MSC形状（A）。计数用DAPI染色的细胞核（未显示）以测量细胞数（B）。拉伸轴为沿着水平方向。在拉伸的MSC与未拉伸的MSC中可以看到MSC对齐的明显差异，并且在2×拉伸的MSC中对齐比1×拉伸的MSC更明显（A）。细胞大小和细胞扩散的更细微差异也在其他地方存在并定量。在测试的实验条件下，MSC的数量没有统计学差异。误差线表示标准差。
MSC mRNA Expression MSC mRNA表达由于先前已经显示形状描述符与特定平滑肌标志物21的表达相关，我们询问细胞长度是否具有类似的相关性，以及这些关系是否受到拉伸方案的影响。使用q-PCR并应用上述报道的拉伸方案，我们证明了MSC长度与平滑肌ACTA 2相关，无论拉伸方案如何（图5A：R = 0.54; p < 0.05），TGLN mRNA表达也是如此（图5 B：R = 0.59; p < 0.05），其分别是平滑肌分化的早期和中期基因标志物28。有趣的是，MSC长度与CNN 1的表达无关，CNN 1是平滑肌分化的另一个中间标志物（图5C）。
细胞长度与平滑肌基因表达的相关性。细胞长度与不依赖于拉伸方案的群体的ACTA 2 mRNA表达显著正相关（A），（R = 0.54，p < 0.05）。无论拉伸参数如何，细胞长度与群体的TGLN表达显著且正相关（B），（R = 0.59，p < 0.05）。细胞长度和CNN1基因表达之间没有显著相关性（C）。
MSC Protein Expression MSC蛋白表达虽然ACTA 2和TAGLN的表达与MSC长度相关，但我们想进一步检查CNN1蛋白的表达是否与MSC长度相关。我们选择了产生最高MSC长度（2 × 10%，持续16 h）的拉伸方案，并将诱导的蛋白质表达与其各自的未拉伸MSC对照进行比较，询问通过循环拉伸产生长度的MSC是否会产生更多蛋白质。Western印迹显示，与其各自的对照相比，用2 × 10%拉伸16小时的MSC表达更多的SMA（从ACTA 2转录的蛋白质）（图6A，p < 0.05）和SM 22（从TAGLN转录的蛋白质）（图6B，p < 0.05）。CNN蛋白表达没有表现出统计学显著的关系（图6C）。
牵拉对平滑肌蛋白表达的影响。蛋白质印迹显示，拉伸至10%的两种16小时方案的细胞比对照表达更多的SMA蛋白（A），（p < 0.05）。对于两个16小时方案拉伸至10%的细胞也表达更多的SM 22蛋白（B），（p < 0.05）。拉伸至10%的细胞与其各自的对照之间的CNN蛋白表达没有统计学差异（C）。将在最大应变（10%）和持续时间（2× 16小时）下拉伸的细胞以及它们各自的对照用抗钙调蛋白染色（（D）：对照;（E）：拉伸的MSC），并将具有明亮信号（高于特定像素强度阈值）的细胞的长度与具有较弱信号（F）的细胞的长度进行比较。近距离观察细胞轮廓，大多数具有强钙调蛋白信号的细胞看起来比具有较弱钙调蛋白信号的较长MSC短。表达强CNN信号的对照细胞或表达少量蛋白质的细胞的长度之间没有统计学差异。表现出CNN弱表达的拉伸细胞显著长于其强表达对应物（p < 0.05）。
由于CNN 1 mRNA表达和细胞长度不相关，并且蛋白质印迹中的CNN蛋白与拉伸没有表现出统计学显著的关系，我们通过荧光显微镜研究了蛋白质的表达。我们注意到，2 × 10%拉伸16 h的MSC的CNN抗体的荧光是不均匀的。我们询问CNN蛋白表达是否与单个细胞基础上的MSC长度相关。我们对细胞进行CNN荧光染色，并研究了具有较高强度（基于高于所选阈值的信号选择）的MSC的长度如何不同于具有较低CNN荧光强度的MSC的长度（图6D和E）。与未拉伸的对照相比，拉伸的MSC确实具有更高比例的具有“高”CNN表达的MSC（36.9%对17.6%）。然而，我们证明了表达“高”CNN的拉伸MSC在统计学上更短（图6 F，D，p < 0.05)并且与对照组的长度相似。在未拉伸的群体中，具有较高表达和较低表达的细胞具有统计学上相似的长度。因此，虽然qRT-PCR和免疫组织化学数据都表明拉伸影响CNN的表达，但表达增加似乎与细胞延长无关。
Associations of MSC shape and alignmentMSC形状和对齐的关联基于这些发现，我们询问MSC形状是否可能比拉伸方案更依赖于对齐。为了研究这一点，我们检查了在任何给定处理后在特定方向上排列的细胞的形状。我们比较了平行于拉伸方向（0-30°）排列的MSC与垂直于拉伸方向（61-90°）排列的MSC。正如我们从细胞角度的评估中所预期的，不仅细胞在单轮拉伸后是各向同性的，而且细胞的形状是相似的，而不管取向如何（图7A和B）。然而，在第二天进行第二次拉伸后，差异出现了，并产生了有趣的模式。我们看到，在一个拉伸方案后，平行于拉伸方向排列的细胞变得比相同取向的细胞长得多（图7A：平行1 × 10% 16 h对2 × 10% 16 h，p < 0.05），并且这些平行排列的MSC比整个群体的平均细胞长度长（图7 B）。 7A：平行vs.所有2 × 10% 16 h，p < 0.05）。垂直细胞在第二次拉伸方案后不再比在单次拉伸方案后更长（图7A：16 h的垂直1× vs. 2 × 10%）。相比之下，在两种拉伸方案后，它们比平行和总细胞群长度短（图7A：16小时的所有对Percular 2 × 10%和16小时的平行对Percular 2 × 10%; p < 0.05）。因此，MSC细胞长度与拉伸相关的变化取决于初始MSC取向。同时，在连续几天重复的两种拉伸方案后，平行排列的MSC与整个群体相比不太圆（图7 B; p < 0.05），而垂直排列的MSC比平行MSC圆得多（图7 B：平行2 X 10% 16小时对比平行2 X 10% 16小时; p < 0.05），并且也比整个群体圆得多（图7 B; p < 0.05）。 7 B垂直2 × 10% 16 h与所有2 × 10% 16 h; p < 0.05）。总的来说，这表明两种拉伸方案是诱导排列变化所必需的，并且细胞形状在整个排列过程中发生变化。对于平行的细胞，一个额外的方案增加细胞长度和减少圆度，而垂直的细胞变得更圆，因为它们沿沿着拉伸方向伸长。总的来说，这表明由循环拉伸诱导的MSC形态取决于细胞取向，并且反过来，对齐在通过循环拉伸产生MSC形态中发挥了工具性功能。
取向对拉伸引起的形态变化的影响。当细胞被拉伸用于第二方案时，整个群体的平均细胞长度将增加（A），（p < 0.05）。通过具体观察与拉伸方向平行取向的细胞，它们在第一和第二周期之间的长度变化甚至更大（A），（p < 0.05）。当考虑垂直于拉伸方向定向的单元时，第二方案对单元长度（A）没有影响。观察细胞圆度显示，10%拉伸的第二方案产生的细胞比仅拉伸单一方案的细胞更不圆（B），（p < 0.05）。在仅平行于拉伸方向取向的细胞中观察到夸大的趋势（B），（p < 0.05）。当考虑垂直取向的细胞时，在第二拉伸方案后细胞更圆（B），（p < 0.05）。
Discussion 讨论循环拉伸的应用已经被积极地用于诱导MSC分化成特定谱系16、24、29、30、31、32，并且还用于产生伸长的细胞形态29。虽然这使得循环拉伸成为组织工程中重要且广泛使用的工具，但我们最近发现，拉伸随机排列的最初各向同性的MSC群体产生了更圆的表型，并且这种圆度是拉伸期间发生的复杂形状重塑过程的结果，并且在拉伸之后继续21。在这里，我们假设参数（例如应变、拉伸时间和拉伸方案的重复）的变化将产生显著不同的MSC形态，包括伸长的MSC，因为这通常是应用循环拉伸的主要目标之一。虽然应变和时间的变化确实产生了不同的形态，但它们不是主要的决定因素。相反，第二天重复的第二种拉伸方案与更多的对齐和指示肌源性分化的延长表型相关。我们的研究结果表明，这第二次重复是诱导与拉伸方向对齐并启动与分化和平滑肌成熟相关的形态表型所需的最小数量的方案。因此，应变和拉伸方案长度的变化是调节剂，其增强或减弱相应拉伸方案的效果。未来的研究可以通过应用超过两个连续运行来研究额外拉伸方案的效果。总的来说，这些发现证实了我们的一般假设，即循环拉伸方案可用于工程化特定MSC形态，其具有通过长度、圆度和圆形度量化的形状的不同方面。
为了产生受控范围的对比MSC形态，我们询问了哪些实验条件，包括对照培养条件，会影响细胞的形状和方向。最高的绝对长度和最低的圆度值代表长而薄的MSC，其通常与肌原性表型相关16，17。我们证实了这种关联，并证明了我们可以用连续几天重复10%拉伸16小时的两种方案来设计长而薄的MSC形态。我们还发现，这些条件导致低圆度，表明细胞扩散。与长而薄的MSC完全相反，我们还设计了一种短而圆的形态，符合未分化细胞的传统观点。这些是通过仅短暂地施加拉伸产生的，因为最小的MSC长度是通过10%拉伸16小时的1种方案产生的，并且通过不施加拉伸产生的，因为随着时间的推移，最高的圆度和最低的纵横比出现在非拉伸对照中。这些数据还强调了生物力学工程形状，生物材料选择和选择生化表型之间的关系。对于本研究，我们使用了浓度为80 mg/ml的刚度优化压缩I型胶原蛋白片，因为这些片与一系列（未拉伸）生物材料中最具SMC样表型相关21。然而，我们证实了调谐拉伸在产生长而薄的MSC形态方面比单独的压缩胶原片更有效。这与工程化环境相关，以生物力学诱导MSC分化的特定谱系。接下来，我们特别证明了ACTA 2和TAGLN的mRNA表达与生物力学产生的细胞长度相关，并且在产生最长MSC形态的方案之后，类似蛋白SMA和SM 22的表达显著更高。虽然该数据的一种解释是ACTA 2和SMA的上调是细胞形状变化和排列的标志，而不是分化本身的成熟指示（ACTA 2和SMA与细胞细胞骨架重塑相关33，34），但圆形和圆形的连续延长和减少表明表达增加超过细胞重定向的阶段。这些数据表明，额外的拉伸和更长的MSC将促进ACTA 2和TAGLN的上调，沿着SMA和SM 22的持续表达，导致更成熟的表型。有趣的是，CNN1 mRNA表达与细胞长度无关，CNN蛋白表达在拉伸细胞中没有统计学上调。事实上，我们观察到拉伸群体中较短的细胞比较长的细胞表达更多的CNN。这意味着并非所有的SMC标志物都必然与细胞长度相关，其他形态学特征，如圆度，可能是更好的分化指标，因为它们与拉伸参数（图2）和基因21的关系更清楚。我们已经将我们的研究集中在平滑肌分化上，因为伸长的MSC形态与SMC标志物的表达增加紧密相关16，17，并且因为生物力学力增加MSC向SMC表型的分化14，15，16。然而，通过生物力学张力工程细胞形状的应用超出了肌原性研究。细胞长度是已经被积极量化并与SMC的分化17、35、36和功能37相关联的少数形状描述符之一，但是对这里引入的附加形状因子的控制适用于与细胞功能和/或分化谱系有关的无数其他研究。形状是否可以在不同时调节MSC分化的情况下进行工程化是一个有趣的问题，仍然有待回答。我们目前正在设计一个系统来分离这些刺激，并确定拉伸和生长因子鸡尾酒是否可以诱导分化，尽管限制和控制细胞的形状。
虽然这项工作有助于识别各种拉伸参数对MSC形态和表型变化的作用，但它也提出了需要在未来研究中解决的其他问题。我们保持不同菌株和持续时间方案的最终时间轴一致，这导致弛豫时间的差异。恒定的端点意味着我们无法解释弛豫时间的这些差异。由于胶原基质和细胞本身本质上是粘弹性的，并且弛豫时间对细胞形态有影响38，因此改变方案之间的弛豫时间可能是令人感兴趣的。这可以通过保持恒定的拉伸和松弛时间来研究，这将导致实验长度的差异。然而，在本研究中，我们更关心的是比较应变和拉伸持续时间的影响，因此决定保持最终终点一致。基于文献，我们还将拉伸循环期间的频率保持在1 Hz，因为先前将循环拉伸应用于MSC的研究使用了1 Hz的频率14，20，39。然而，一项研究比较了不同的频率，并证明1 Hz与2.75 Hz对MSC排列没有显著影响，但对细胞形状指数有显著影响，其与本文使用的圆度相当。有趣的是，在1%应变下的2.75 Hz表现出与在5%和10%应变下的1 Hz频率相同的趋势16，如这里所应用的。然而，可以非常合理地证明，应变速率影响拉伸细胞的表型，因为这与材料和细胞粘弹性直接相关。我们自己可能已经看到了这种现象;为了在与5%应变相同的时间内实现10%应变，平均应变速率实际上是两倍。很可能是这种差异驱动了这里报告的对拉伸的反应，而不是最大应变本身。未来的研究可以通过将最大应变与应变率解耦来研究这种影响。然而，将正弦波函数与速率变化相匹配可能具有挑战性。解决这个问题可能需要调整一个用于跨不同频率空间进行比较的函数。这项工作产生的另一个问题是，拉伸如何影响单个细胞。我们已经开发出了检测单个细胞的形状如何响应生物力学刺激而改变的方法，但我们对这些细胞的生化分析一直是对整个群体的。这将是非常有用的，以检查单个细胞是如何响应异质性结合到一个非同质的材料，以及这些差异如何表现在mRNA和蛋白质水平上的分化标志物的表达差异。E. G. 单细胞PCR甚至研究单细胞局灶性粘附的发展可以帮助确定异质株对MSC的影响。
本研究的另一个重要发现是循环拉伸对MSC排列和相应形状的影响。已经显示对齐对于MSC分化是重要的40，但是当将两个连续拉伸方案的显著效果分解为对平行对齐与垂直对齐的MSC的效果时，变得明显的是，平行对齐的MSC的细胞长度急剧增加，而垂直对齐的细胞没有。为了更好地理解这些意想不到的结果，有必要更详细地描述这种拉伸响应作为拉伸前初始细胞排列的函数。平行于拉伸方向一致排列的细胞沿着拉伸轴伸长，并收缩垂直于拉伸方向的任何突起。从数量上看，这导致细胞更长，不那么圆，并且随着额外的拉伸而不那么圆。恰好开始垂直于拉伸方向的细胞收缩了它们的垂直轴，并开始沿着拉伸轴伸长，导致了一个看似重新定向的细胞。定量地，第一拉伸方案使垂直的MSC更短、更圆、更圆，并且这种形状与未拉伸的对应物相似。只有第二拉伸方案增加了沿着垂直轴的收缩和沿沿着拉伸轴的伸长，这使得MSC在数量上更长，圆形和圆形更少，解释了对齐如何对生物力学工程形状具有不同的影响。重要的是，大多数MSC最初既不平行也不垂直于拉伸轴。因为这些细胞最初收缩远离垂直方向，然后沿着拉伸轴伸长和重新定向，并且因为它们构成了种群的大多数，它们的行为驱动了我们第一个结果中呈现的平均种群值。此外，这些数据强调，MSC对齐理论上可以通过整体MSC形态的变化来解释，而不仅仅是长度。事实上，我们发现，当作为单一群体拉伸和分析时，各向同性铺板的MSC将经历其形态变圆、更圆和更短的阶段。通常，该阶段发生在单次拉伸方案之后，并且仅在第二次拉伸方案之后，MSC才开始与拉伸对齐并显示通常与生肌表型相关的生物力学工程化形态。为了更好地观察MSC形态的这些复杂变化，考虑具有平行、垂直和倾斜排列的3种假设MSC是有帮助的（图8A）。因为这些数据共同表明，通过施加循环拉伸来工程化MSC形状高度依赖于MSC对齐，并且反过来，重复拉伸方案对于控制这种对齐是必要的，因此可以设想通过生物材料设计或其他工程控制来控制细胞对齐，以最大化拉伸对MSC形态和分化的影响。
MSC形状的变化作为细胞取向、拉伸方向和基质的函数。这里是3个假设的MSC由于拉伸和初始取向而经历的变化的三个示意图（A）。细胞核为蓝色，细胞轮廓为棕色和星形，以可视化与所施加拉伸的方向平行和垂直的形状的夸大变化，所述方向为从左到右，水平。在平行单元对齐的情况下（参见第一行，最左边的单元指向0度），MSC在拉伸方向上变得更长，同时收缩垂直单元延伸。这种变化增加了长度，并降低了圆度和圆度。在垂直单元对齐的情况下（参见第二行，最左边的单元指向90度），单个MSC首先在垂直方向上收缩，并沿着拉伸方向延伸，最终看起来像是简单地重新定向。这种变化产生更圆和更圆的细胞，在额外的拉伸将其形状恢复到细长形态之前，细胞的长度减小。在倾斜单元对齐的情况下（参见第三行，其中最左边的单元指向45度），伸长的MSC被拉伸，并且其远离90度收缩突起并在拉伸方向上伸长。从数学上讲，这遵循垂直单元，但在夸张的程度上。总的来说，这3种假设的MSC的形态变化突出了拉伸不同排列的MSC如何改变其所得的形态。下一个图显示了在不同基底上接种诱导的排列和形状的差异（B）。MSC接种在胶原包被的硅胶上，垂直于拉伸方向排列，而MSC以相同浓度接种在胶原片上，平行于拉伸方向排列。当细胞嵌入胶原蛋白的3D水凝胶中并拉伸时，细胞平行于拉伸方向排列。
从这个角度来看，我们的研究结果大大扩展到使用适当的生物材料拉伸和工程的粘附细胞的形状的重要性。许多先前的研究已经报道了MSC和SMC在单轴拉伸下对齐。在3D纤维蛋白水凝胶内，细胞已显示平行于拉伸15排列，但在2D蛋白质涂覆的硅胶上，MSC和血管细胞据报道垂直于拉伸轴排列14、16、20、25、26。可以推测，当在不同尺寸条件下培养时，MSC对力的反应不同。我们在这里表明，当接种在胶原蛋白上时，我们可以刺激MSC在2D基底上的平行排列，这是以前仅在3D中观察到的干细胞现象。也就是说，在2D胶原基质上拉伸骨肉瘤细胞的研究也显示了平行排列27。我们简要地调查了这一现象，并发现了确证的结果。当我们将MSC铺在I型胶原包被的硅酮表面上并拉伸时，它们垂直于拉伸轴对齐（图8B），如14、16、20、25、26所示。当接种在2D胶原蛋白片的表面上并拉伸时，MSC平行于拉伸轴排列（图8B），与27相当。然而，接种在3D胶原水凝胶内的MSC平行于拉伸方向排列（图8B），如它们在纤维蛋白凝胶15中所做的那样。基于这些结果，很明显，底物在所得细胞排列中起关键作用。在15中，假设指出这种差异是由刚度驱动的，并建议需要使用相同材料和不同刚度进行测试以进行确认。在这里，我们提出了另一种解释：这是基板的类型，决定对齐。在我们报告的结果和其他结果中，非纤维基材（如硅胶）引起垂直对齐，而纤维基材在响应机械应力时（如果不是诱导性的话）有利于平行对齐，这是合理的。我们将该理论建立在图8所示的结果的基础上，沿着，与薄硅胶片相比，此处使用的胶原蛋白片具有相似的机械性能。需要更多的实验来辨别确切的原因，但无论结果如何，这里提供的数据表明，基质选择在MSC的生物力学可实现的形状和分化潜力中起着重要作用。
这项工作的另一个有趣的延伸将是研究局灶性粘连的发展以及细胞结合如何影响形状，整合素信号级联和分化。当检查配体-细胞亲和力对平滑肌分化的影响时，发现表面积和细胞纵横比的控制强烈影响该过程41。其他研究小组已经操纵细胞区域19和细胞扩散18，通过改变可用于粘着斑的区域来控制随后的干细胞分化。先前，焦点粘附力的发展也与基底刚度42相关联，并且也可以通过机械力43、44来刺激。这些在整联蛋白结合位点的粘着斑调节肌动蛋白细胞骨架并影响ERK/MAPK途径45，其已被证明有助于肌原性成熟和干细胞分化46，47，48。参考文献49综述了ECM相互作用影响干细胞命运的其他方式。
最后，我们已经证明在本研究中，MSC形状变化的特定方面下循环拉伸，可以通过不同的形状描述符。虽然对使用细胞长度的一般强调提供了对变化的表型的实质性洞察17，35，36，37，但仅关注该形态特征可能会忽略多个其他形状方面。因此，我们提倡使用一组形状描述符，如本研究中使用的或我们以前的研究中介绍的，用于定量描述MSC形状。
总之，通过施加循环拉伸来工程化MSC的几何形状是可能的，并且其对分化的强烈影响使其成为一个年轻且有前途的领域。应变和拉伸方案的持续时间的变化不是生物力学工程细胞形状的主要决定因素;相反，它是所选择的拉伸方案的重复，表明工程形状和分化是依赖于持续的生物力学刺激的复杂的非线性过程。此外，底物的选择和初始细胞排列通过生物力学力在细胞形状的工程中发挥作用。我们设想通过临床上适用的力转换的靶向设计增强效果，因此，可以在植入前使用短暂的拉伸进行调节，从而支持和指导形状的生物材料，如本研究所示。展望未来，随着干细胞在体内持续暴露于动态生物力学环境，这里介绍的概念将帮助我们微调细胞形状和相关表型的生物力学工程，最终通过利用患者体内自然发生的体内力来促进更好地体内控制细胞用于再生治疗。
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